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Evaluation and Comparison of Various PCR Methods for Detection of Mycoplasma gallisepticum Infection in Chickens

Maricarmen García, Nilo Ikuta, Sharon Levisohn and S. H. Kleven
Avian Diseases
Vol. 49, No. 1 (Mar., 2005), pp. 125-132
Stable URL: http://www.jstor.org/stable/1593483
Page Count: 8
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Evaluation and Comparison of Various PCR Methods for Detection of Mycoplasma gallisepticum Infection in Chickens
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Abstract

Four generic Mycoplasma gallisepticum (MG) polymerase chain reactions (PCRs) (16S rRNA PCR, three newly developed PCR methods that target surface protein genes [mgc2, LP (nested) and gapA (nested)]) were compared for analytical specificity and sensitivity and for diagnostic sensitivity (Se) and specificity of detection from tracheal swabs. The licensed MG DNA Test Kit Flock Chek test (IDEXX, Laboratories, Inc., Westbrook, ME) was as well evaluated for the diagnostic specificity and sensitivity of detection from tracheal swabs. Analytical specificity was evaluated for the four generic PCR methods using a panel of DNA samples from microorganisms that may be isolated from the trachea of commercial poultry and other fowl. PCR methods mgc2, nLP, and ngapA only amplified DNA from MG, whereas 16S rRNA PCR amplified DNA from MG and Mycoplasma imitans. The analytical sensitivity of the four generic PCR methods expressed in color-changing units (CCU)/amplification reaction was estimated for each PCR method and ranged from 4 to 400 CCU/reaction; the sensitivities of single PCR methods 16S rRNA and mgc2 were estimated at 40 CCU/reaction, the nLP at 400 CCU/reaction, and the ngapA at 4 CCU/reaction. The diagnostic sensitivity and specificity of MG detection from tracheal swab pools, as compared to isolation from choanal cleft swabs, was evaluated for the five PCR methods using three groups of birds exposed to vaccine strains ts-11 and 6/85 and to challenge strain R. All PCR methods were able to detect the vaccine strains and the challenge strain R directly from tracheal swabs, indicating that PCR primers from the different methods amplified divergent MG strains. Isolation and PCR results correlated satisfactorily among the three experimentally infected groups, with agreement values (k) ranging from 0.52 to 1.00. The ngapA, IDEXX, and mgc2 PCRs showed the best sensitivity (Se) ratios for detection of M. gallisepticum strains as compared to isolation. Compared to the ngapA and IDEXX PCR methods, the mgc2 PCR has a faster turnaround time, since this test consists of a single amplification reaction and the amplification product is detected by gel electrophoresis. Therefore, among the PCR methods evaluated in this study, the mgc2 PCR is the method of choice to further validate in the field. /// Se comparó la sensibilidad y especificidad analítica, la sensibilidad diagnóstica y la especificidad para la detección de Mycoplasma gallisepticum (MG) en hisopos traqueales, de cuatro pruebas genéricas de reacción en cadena por la polimerasa (por sus siglas en Inglés PCR): PCR para el ARN ribosomal del segmento 16S y tres nuevos métodos de PCR que amplifican los genes de las proteínas de superficie: mgc2, LP (anidado), gapA (anidado). A su vez, se evaluó la sensibilidad diagnóstica y especificidad de la prueba certificada de ADN para MG "Flock Check Test" (Laboratorios IDEXX, Westbrook, ME). Se evaluó la especificidad analítica de los cuatro métodos genéricos de PCR utilizando un panel de muestras de ADN provenientes de microorganismos que pueden ser aislados de la tráquea de aves comerciales y de otras aves. Los métodos de PCR mgc2, nLP, y ngapA solo amplificaron ADN proveniente de MG, mientras que el PCR para el ARN ribosomal del segmento 16S amplificó ADN proveniente de MG y Mycoplasma imitans. Se estimó la sensibilidad analítica de las cuatro pruebas genéricas de PCR expresándose en unidades de cambio de color/amplificación de la reacción, estableciendo un rango de cuatro a 400 unidades de cambio de color/reacción. La sensibilidad individual del PCR para el ARN ribosomal del segmento 16S y el PCR mgc2 se estimó en 40 unidades de cambio de color/reacción, para el PCR nLP en 400 unidades de cambio de color/reacción y para el ngapA en 4 unidades de cambio de color/reacción. Para los 5 métodos de PCR se evaluó la sensibilidad y especificidad diagnóstica para la detección de MG en hisopos traqueales en comparación con el aislamiento en hisopos cloacales, utilizando para ello tres grupos de aves expuestas a las cepas vacunales ts-11, 6/85 y cepa R de desafío. Todos los métodos de PCR fueron capaces de detectar las cepas vacunales y la de desafío directamente de hisopos traqueales, lo que indica que los diferentes métodos amplificaron cepas divergentes de MG. Los resultados de aislamiento y PCR correlacionaron satisfactoriamente entre los tres grupos infectados experimentalmente, con valores de asociación en el rango de 0.52 a 1.00. En comparación con el aislamiento, los métodos de PCR mgc2, IDEXX y ngapA mostraron los mejores rangos de sensibilidad para la detección de cepas de MG. Comparado con los métodos de PCR IDEXX y ngapA, el método de PCR mgc2 tiene un tiempo de respuesta mas rápido debido a que esta prueba consiste en una sola reacción de amplificación y el producto amplificado se detecta por electroforesis en gel. Por lo tanto, de los métodos de PCR evaluados en este estudio, el mgc2 es el método a escoger para su posterior validación a nivel de campo.

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